2.酶联免疫吸附试验(ELISA)和斑点－酶联免疫吸附试验(Dot－ ELISA)：ELISA以96孔聚苯乙烯微滴板作为包被抗原或抗体的固化介质，加入待测血清，孵育后洗涤多余的血清成份，再加酶标记抗球蛋白使与抗原－抗体复合物相结合，经洗涤，最后加入底物，测定被酶降解后的底物量，即相当于抗体存在的量。凡大于或等于阴性对照OD均值(x)加3个标准差(SD)可判为阳性，黑热病ELISA与病原检查阳性的符合率为 100％。值得注意的是与麻风病有23％的交叉反应。

Dot－ELISA是在ELISA基础上发展的一种简易的、而敏感和特异性均不亚于ELISA的检测方法。此法用硝酸纤维膜作为固相载体，其它操作与ELISA同。由于硝酸纤维膜能较强地吸附抗原，且可定量控制，避免了可溶性抗原吸附聚苯乙烯微滴板时的批间差异。观察结果乃根据斑点的出现与否，目测即可，不受分光光度计读数的限制。而且记录可长期保存。黑热病患者的血清，在稀释度为1:100－1:800时均可出现蓝色斑点，与病原检查阳性的符合率为97.6％。与疟疾、肺吸虫、麻风等疾病未出现交叉反应。经锑剂治疗后1－2年的黑热病患者，当血清为1:200－1:800稀释时，阳性率为66％。现症患者干血滴标本的阳性率仅为37.6％。

3.免疫层析诊断试条(ICT)：此法是把免疫亲和技术、印渍术和经典的薄层层析技术组合在一起的新技术（即dipstick）。以恰氏利什曼原虫(Leishmania chagasi)的类Kinesin基因中39个氨基酸重组片段的表达产物－rk39为重组抗原制备成免疫层析诊断试条。检测时，取黑热病患者全血或血清一滴(约20－30μl)于样本垫上，通过层析，于3－5分钟内，出现与抗原结合的阳性条带，目测即可。此法快速敏感，与病原检查的符合率可达100％，是目前颇受基层防疫单位欢迎的诊断方法。同样，亦可用重组抗原rk39进行ELISA诊断黑热病现症患者，所用的重组抗原工作浓度为 1:3000，检出的抗体阳性率为96.2%，与原虫检出的符合率达100％，仅个别麻风病患者抗体OD>0.43. 此法特异性、敏感性高，且有稳定的重复性。

黑热病循环抗原的检测不但可提示宿主的活动性感染，亦可反映感染度及用作疗效考核。常用的技术有以下3种。

1.酶标记单克隆抗体斑点－ELISA直接法：以过氧化物酶标记特异性抗杜氏利什曼原虫单克隆抗体，直接结合于待测样本中的循环抗原。从此法检测黑热病现症患者血清中相应的CAg，阳性率为90.6%，根据历年血清检测结果分析，以新鲜血清为佳，阳性率可达100％，而保存三年的血清阳性率仅 为80％。对治愈后3个月至16年的黑热病患者50份进行检测，未见阳性反应。直接法实验操作简便，全过程为4小时。单克隆抗体－抗原斑点试验(McAb-AST)，亦用于黑热病循环抗原的检测，但加有待测样本的硝酸纤维膜，需经McAb孵育过夜后，再与HRP标记的第二抗体作用。其检测阳性率为97％。25例经锑剂一疗程后一年左右用本法检测，13例呈阴性，12例呈中度或弱阳性反应。上述两种方法都可用来对黑热病作疗效考核。

2.单克隆抗体－酶联免疫印渍技术(McAb-EITB)：应用聚丙烯酰胺凝胶具有将抗原蛋白组分分离成单一区带和分辨率高的特点，然后通过电泳将蛋白组分转移至硝酸纤维膜上，以膜作为载体进行固相酶免疫试验。用辣根过氧化物酶标记抗杜氏利什曼McAb后用于EITB检测黑热病CAg，可减去使用第二抗体的步骤，不但简化操作，并提高了分辨率和特异性。以130kD、100kD和25kD为黑热病特异条带，检测25例经病原确诊的患者血清均呈阳性，而与正常人及其它疾病均无交叉反应出现。

3.双抗体夹心斑点－酶联免疫吸附试验(Sandwich Dot－ELISA)：将含有特异性抗体的免疫球蛋白，致敏载体(硝酸纤维膜)，与待测抗原孵育后，加入酶标记特异性单抗结合物，结合物即与载体表面的抗原－抗体复合物相结合，当加底物后，可肉眼观察斑点的出现。这种应用特异性单克隆抗体的双抗体夹心Dot－ELISA法，测检我国新疆克拉玛依地区的皮肤利什曼病患者的循环抗原，其阳性率为83.3％，较皮肤组织直接涂片镜检原虫的检出率22.2％提高4倍。

鉴别诊断

黑热病应与下列疾病作鉴别诊断。

1．白血病：慢性骨髓白血病与慢性淋巴性白血病的患者大都是成人，有脾肿大、贫血以及鼻衄和齿龈出血等症状，很象黑热病，经血常规检查即可鉴别，此种病人的白细胞大量增加，一般在10万/mm³以上。前一种患者的粒细胞占80－95％，后者则主要是淋巴细胞，且有淋巴结肿大。儿童患白血病较成人为少，大都是急性白血病，主要症状有面色苍白，显著衰弱，颈间淋巴结肿大，口疮以及各种出血现象。在鉴别诊断上，该病的白细胞计数可能增至10万/mm³以上或减少到1000/mm³左右，血液内出现异常的无粒单核白细胞，其数占白细胞总数的60－80％，红细胞及血小板均显著减少，该病的病程颇速，如延误治疗，数月内即可死亡。

2．荚膜组织胞浆菌病(Histoplasmosis)：病原体为荚膜组织胞浆菌(Histoplasma spp)，近年来该病在我国的湖北、四川、广西、浙江、江苏和云南等省均有查见。播散性荚膜组织胞浆菌病的患者肝、脾肿大，贫血以及白细胞和血小板减少，从病人的骨髓、脾或淋巴结抽出物中见到的病原体也极易与利什曼原虫相混淆，每多误诊为黑热病。但该病的病原体内部结构与利什曼原虫不同，也看不到动基体的构造；患者ICT检测呈阴性，可用组织胞浆菌素作皮内试验以及真菌培养的方法确定诊断。

3．班替氏综合症 (Banti’s diseases)：此病的病程可分三期，初期仅有贫血和脾肿，中间期肝脾

上一页  [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 下一页